實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，一般可以用PCR儀自帶的軟件進(jìn)行收集、分析。但即使有了方便可靠的軟件，我們也需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行檢查、再分析，評(píng)估數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性。

這需要三個(gè)基本的步驟。

第一步，查看擴(kuò)增曲線(xiàn)，有必要時(shí)調(diào)整基線(xiàn)和閾值。

Ct值由基線(xiàn)和閾值計(jì)算得來(lái)，所以他們的值對(duì)結(jié)果影響很大。軟件會(huì)給出1個(gè)默認(rèn)的基線(xiàn)和閾值，但不一定是最合適的，需要我們進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整。

首*行基線(xiàn)的調(diào)整。

一般范圍是循環(huán)數(shù)3～15，使得靶基因的擴(kuò)增信號(hào)大于背景噪聲。出現(xiàn)不正常的擴(kuò)增曲線(xiàn)，通常是因?yàn)樵O(shè)置了不正常的基線(xiàn)，需要對(duì)單個(gè)孔進(jìn)行設(shè)置。

比較好的做法是，基線(xiàn)的最小值（起始循環(huán)數(shù)）設(shè)置在背景噪聲的尾巴后，最大值（結(jié)束循環(huán)數(shù)）設(shè)置為擴(kuò)增起始點(diǎn)。

循環(huán)范圍在5個(gè)循環(huán)就可以，具體跟擴(kuò)增曲線(xiàn)的對(duì)數(shù)圖來(lái)設(shè)定。

擴(kuò)增曲線(xiàn)的對(duì)數(shù)圖是什么？下期告訴你