今天給大家分享一下在用磷酸化抗體做Western Blot時(shí)，應(yīng)該注意些什么。

1.警惕內(nèi)部敵人

一定要在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，因?yàn)榻M織或細(xì)胞裂解時(shí)會(huì)釋放出大量磷酸化蛋白的死對(duì)頭——內(nèi)源性蛋白磷酸酶，催化磷酸化蛋白(R-p)的去磷酸化，導(dǎo)致不同于正常生理狀態(tài)的差異。因此，外源性加入蛋白磷酸酶抑制劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維護(hù)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，否則即使 band 壓出來(lái)也會(huì)很淺，結(jié)果也不可信。

2.低溫能讓他們緊緊地?fù)肀?duì)方

加一抗后最好 4 度過(guò)夜，低溫能讓抗體和目的蛋白緊緊地?fù)肀?duì)方。為什么？因?yàn)榈鞍卓乖谀ど峡康氖俏锢砦?，高溫下容易脫落。膜上的抗原脫落了，結(jié)合效率會(huì)低。4 度也可使一抗重復(fù)使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。（土豪隨意）磷酸化的蛋白只占總的蛋白量的極少部分，就像聯(lián)誼舞會(huì)上讓來(lái)賓多相處一會(huì)產(chǎn)生 couple 的概率會(huì)大很多那樣，過(guò)夜可以保證抗體和蛋白有充分的結(jié)合時(shí)間。二抗則室溫 1 小時(shí)即可。

3.磷酸化抗體哪家強(qiáng)？

當(dāng)然是 Cell signaling 公司。他家做的磷酸化抗體不錯(cuò)，尤其是 MAPKs 磷酸化抗體。最好根據(jù)廠商的 protocol 來(lái)操作實(shí)驗(yàn)，這是實(shí)驗(yàn)成功的保證。

4．他們不宜“喝奶"

建議用含 5%BSA 的 TBST 稀釋 phospho-p38 等抗體，效果不錯(cuò)，而不是用常見的含 5%nonfat milk 的 TBST。因?yàn)槊撝毯姿峄鞍棕S富，是奶中磷元素的來(lái)源之一。

5.如何避免磷化蛋白君和總蛋白君在膜上“打架"？

研究完某一蛋白的磷酸化情況后一般也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量。但兩者的條帶位置一樣，怎么做？可以這樣：壓完磷酸化抗體后，把相同的 membrane 做 strip 后再壓總蛋白抗體,然后再 strip 一次，再壓內(nèi)標(biāo) actin。

6.聽 marker 的，沒(méi)錯(cuò)

做磷酸化蛋白 WB 時(shí),除了目標(biāo)蛋白的 band 以外,往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的 band。磷酸化抗體 不好的話,甚至?xí)撼龇翘禺愋缘?band,而沒(méi)有你想要的 band,所以壓片以后,一定要根據(jù) markers 比對(duì)一下,你壓出的 band 分子量是否正確。

7.洗滌也大有學(xué)問(wèn)

洗滌對(duì)最后的背景影響也較大，millipore 最近的說(shuō)明書推薦用雙蒸水洗滌，效果很明顯，具體可以這樣：1st and 2nd 抗體之間，DDW 5min X3 次，2nd 抗體后，DDW 5min X3 次，TBST  5min X1 次，DDW rinse 3-4 次。對(duì)比 TBST 洗滌的 membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使壓片 30min，背景仍然是可以忽略的。